شکل۱-۱۳: رسم منحنی استاندارد. ۳۳
شکل ۳-۱: ویال های آماده برای PCR روی یخ ۵۲

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

شکل ۴-۱: رشد باکتری در حضور دیسک XV و عدم رشد در حضور دیسک X و V 65
شکل ۴-۲: رنگ آمیزی گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسیل های گرم منفی ۶۶
شکل ۴-۳: نتایج PCR برای ست پرایمر A و B 67
شکل ۴-۴: نتایج PCR برای ست پرایمر C و D 69
شکل ۴-۵: مدل های پیشنهادی برای جایگاه capb در نمونه های انتخاب شده ۸۱
شکل۴-۶: نتایج PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها ۸۲
فهرست نمودارها
نمودار ۴-۱: بیان نسبی capb نسبت به ژن مرجع rpoB 76
نمودار ۴-۲: بیان نسبی IS1016 نسبت به ژن مرجع rpoB 76
نمودار ۴-۳: تعداد کپی در دو جایگاه capB و IS1016 نسبت به جایگاه rpoB در نمونه ها ۸۰
خلاصه فارسی
هموفیلوس آنفلونزای تیپ‌ب (Hib) از مهمترین عوامل ایجاد مننژیت باکتریال در نوزادان و کودکان می‌باشد. مهمترین عامل بیماری‌زایی این باکتری کپسول پلی‌ساکاریدی از جنس PRP می‌باشد که تولید آن تحت کنترل گروهی از ژنها می‌باشد که در جایگاهی به نام capb قرار دارند. واکسیناسیون علیه این بیماری در بیشتر کشورهای جهان انجام شده ولی ایران هنوز به طرح واکسیناسیون سراسری نپیوسته است، به همین دلیل تولید واکسن بومی هموفیلوس آنفولانزا یک ضرورت محسوب می‌شود. هدف از این مطالعه آنالیز مولکولی ژنوم باکتری برای انتخاب یک سویه بومی واکسینال می‌باشد. در این تحقیق ابتدا نمونه‌های مشکوک به روش PCR و با بهره گرفتن از ۴ جفت پرایمر اختصاصی شناسایی شد، میزان PRP نمونه‌ها به روش بیال اندازه‌گیری شد، سپس تعداد کپی جایگاه cap در نمونه‌های منتخب به روش Real Time PCR و با بهره گرفتن از ۳ جفت پرایمر طراحی شده برای مناطق IS1016، capb و ژن تک‌کپی rpoB با متد Abslute Quantification مشخص شد. در نهایت ژنوتیپ نمونه‌های منتخب با بهره گرفتن از دو جفت پرایمر اختصاصی مشخص شد.از میان ۳۰ نمونه ۱۸ مورد Hib ،۱۱ مورد غیر از هموفیلوس آنفلونزا و یک مورد Hib‾ تشخیص داده شد. از میان ۵ نمونه منتخب دو نمونه دارای ۳ کپی از جایگاه cap بوده و ۳ نمونه دارای دو کپی از این جایگاه تشخیص داده شدند. در مرحله آخر تمام ۵ نمونه ژنوتیپ I تشخیص داده شدند. در این مطالعه برای اولین بار در ایران تعیین تعداد کپی و ساختار ژنوم جایگاه cap در سویه‌های بومی انجام شد.
کلمات کلیدی: هموفیلوس آنفلونزا، Real time PCR، مننژیت ، Hib
فصل اول
کلیات
۱-۱: تاریخچه
هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال ۱۸۹۲ به وسیله فایفر جدا گردید و تا اوایل دهه ۱۹۳۰، اکثر دانشمندان آن را عامل مولد آنفلونزای اپیدمیک می دانستند. زیرا عموماً همراه با این بیماری بدست می آمد(۸). در سال ۱۹۳۳ مسلم گرید که عامل بیماری آنفلونزا ویروس است و این باکتری یک مهاجم ثانوی در اپیدمیها می باشد(۱). البته در پاندمی های اخیری که ویروس آنفلونزا عامل آن بوده، نقش نزدیک از این باکتری با ویروس آنفلونزا دیده نشده است و بدین دلیل مسئله سینرژیسمی بین ویروس و باکتری در بیماری های انسانی ناشناخته به نظر می رسد. بنابر این نام آنفلونزا اهمیت اتیولوژیک ندارد(۸). آنفلونزا معمولا منصوب به عنوان ” flu"، یک بیماری ویروسی است که بوسیله التهاب حاد مسیر هوایی ناحیه فوقانی دستگاه تنفسی مشخص می گردد. علائم، اغلب با التهاب شدید غشاء مخاط بینی، سردرد، برونشیت و درد عضلانی عمومی شدید^[۱] پیشرفت می کند(۴۸).
کاملترین مطالعات توسط مارگارت پیتمن بین سالهای ۱۹۳۰ تا ۱۹۴۰ صورت گرفت ، او فیزیولوژی، بیماریزایی، مصونیت، اپیدمیولوژی و خصوصیات این باکتری را به صورت کامل شرح داد(۱). نام جنس هموفیلوس از دو ریشه یونانی هم ^[۲]به معنای خون و فیلوس ^[۳]به معنای دوست داشتن گرفته شده است(۲۰) . بر اساس کتاب باکتریولوژی برِگِی^[۴]، ۱۰ گونه از هموفیلوسها در ارتباط با انسانها نام گذاری شده اند که یکی از آنها گونه آنفلونزا می باشد. بعلاوه ۶ گونه نیز در ارتباط با حیوانات بوده و ۳ گونه نیز حالت نامشخص دارند.
۱-۲: خصوصیات عمومی جنس هموفیلوس:
جنس هموفیلوس شامل باکتری های کوکوباسیلی یا میله ای شکل، گرم منفی، و پلئومورفیک بوده که در اسمیر های مستقیم ممکن است شکل آنها در زیر میکروسکوپ، از کوکوباسیل های کوچک تا فیلامنت های بلند متفاوت باشد(۲۰). ابعاد آنها به ندرت از ۳/۰ × ۵/۱ میکرون تجاوز میکند. دو انتهای سلول آنها گرد بوده و کپسول در صورت مشاهده با میکروسکوپ در اشکال صاف وجود دارد(۸). در نمونه های حاصل از عفونت های حاد، ارگانیسم ها به صورت باسیل های کوکوئیدی شکل کوتاه هستند که گاهی اوقات بصورت دوتایی یا زنجیره کوتاه قرار میگیرند(۲). دو جنس هموفیلوس و پاستورلا، به خانواده پاستورلاسه تعلق دارند. از نظر خصوصیاتی، اعضای خانواده پاستورلاسه، گرم منفی، پلئومورفیک، کوکوئیدی، غیر متحرک، هوازی یا بی هوازی اختیاری بوده، نیتریت ها را در اثر احیاء نیتریت ها بدست می آورند و اکسیداز و کاتالاز + می باشند. شکل (۱-۱) شیوع این ارگانیسمهای سخت رشد را در ارتباط با دیگر باسیل های گرم منفی یافت شده در نمونه های کلینیکی نشان می دهد(۴۸).
همانطور که گفته شد، هموفیلوس باکتری هوازی اختیاری است، اما به طور ضعیف در غیاب اکسیژن رشد می کند. افزایش ۱۰-۵ % Co₂ بهمراه انکوباسیون، رشد بسیاری از سویه ها را افزایش می دهد. مقدار گوانین+ سیتوزین DNAی جنس هموفیلوسmole %44-37 می باشد(۴۸) .
شکل۱-۱: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد
از حدود ۱۷ گونه از هموفیلوس های شناخته شده عده ای جزء فلور طبیعی دهان و نواحی فوقانی دستگاه تنفس انسانها و عده ای نیز در حیوانات یافت می شوند(۸). حدود ۱۰% کل فلور باکتریایی دائمی دستگاه تنفسی فوقانی را هموفیلوس ها تشکیل می دهند(۳۸). برخی از آنها در انسان بیماری زا می باشند(۸). گونه اصلی بیماریزا هموفیلوس آنفلونزاست که بطور طبیعی در سیستم حلقی- دهانی برخی افراد سالم یافت می شود. بعضی از سویه های آنها دارای کپسول وبرخی دیگر فاقد آن هستند، که دسته بدون کپسول دارای قدرت بیماریزایی ضعیفتری نسبت به سویه های کپسولدار می باشند. هموفیلوس آنفلونزا در انسان ایجاد عفونت می کند(۴۵) و مخزن حیوانی ندارد(۱۰).
از گونه های عمده ساکن در دستگاه تنفسی فوقانی، گونه پاراآنفلونزاست که ۴/۳ % از کل میکروفلورهای هموفیلوس را در بر میگیرد. سویه های هموفیلوس آنفلونزای بدون کپسول معمولا چندین بیوتایپ داشته و در فارنکس بیشتر کودکان سالم یافت می شوند. اما به طور نرمال کمتر از ۲% فلورهای باکتریایی کل را تشکیل می دهد. با افزایش سن افراد هموفیلوس آنغلونزا فراوانی کمتری را به عنوان فلور حلق نشان می دهد(۳۸).
۱-۳: نیازهای غذایی
هوفیلوس آنفلونزا یکی از پر نیازترین باکتری ها بوده و به وجود خون در محیط کشت نیاز دارد(۸). عدم توانایی رشد هموفیلوس در غیاب خون یا فرآورده های آن، مربوط به دو نیاز غذایی است که اولی، هِمین یا هِم شناسایی شد که به آن فاکتور X می گویند(۷۳). این فاکتور به حرارت مقاوم بوده و برای رشد هوازی ارگانیسم مورد نیاز است(۹). فاکتور X همچنین میتواند پروتوپورفیرین IX و دیگر ترکیبات منسوب به آن که دارای آهن هستند را شامل شود(۱۷). این نوع ترکیبات برای سنتز آنزیم های تنفس هوازی ضروری بوده، از این رو، سویه ها برای رشد بی هوازی، به فاکتور X نیازی ندارند. عقیده بر این است که هِم برای سنتز کاتالاز لازم بوده و میتوان به جای آن سیستئین به کار برد. سیستئین، پراکسید را احیاء کرده و نیاز به کاتالاز را برطرف می سازد(۸). احتیاج به این گروه از ترکیبات، به دلیل ناتوانی سویه های وابسته به X است که توانای تبدیل ALA ^[۵] به پروتوپورفیرین را دارا نمی باشند، که پروسه ای دارای چندین مرحله با آنزیم های مختلف می باشد(۱۷).
دومین فاکتوری که برخی از گونه های هموفیلوس برای رشد به آن وابسته است. نیکوتین آمید دی نوکلئوتید (NAD) و یا نیکوتین آمید دی نوکلئوتید فسفات شناسایی شده که به آن فاکتور V می گویند. (۱۷،۷۳). لازم به ذکر است که اسید نیکوتینیک یا نیکوتین آمید نمیتواند جایگزین این فاکتور شود. ظاهراً مولکول کوآنزیم کامل را باید فراهم کرد و بنظر می رسد که این ماده حساس به حرارت، همین فاکتور V نام برده می باشد که در عصاره مخمر، انواع سبزیجات و همچنین خون کامل یافت می شود(۸).
هر دو فاکتور X و V در داخل گلبولهای قرمز خون یافت شده و برای رشد در محیط لازم می باشند(۲۰). البته باید خاطر نشان کرد که گونه های مختلف ممکن است به یکی از فاکتورها و یا هر دوی آنها نیازمند باشند که الگوی وابستگی به X و V یا XV معیاری است برای تمایز بین گونه ها(جدول ۱-۱).
جدول ۱-۱: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V