برای شروع بلوغ اووسیت ها در میوز I که در مرحله ی G2 توقیف شده اند و برای ایجاد وقفه در پیشرفت چرخهی سلولی در یک مرحله متافاز مانند در انتهای میوز II.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
شواهد فراوانی در مورد فعالیت میتوزی خاص MAPKها در سلولهای جانوری وجود دارد. اگرچه، به نظر میرسد MAPK برای میتوز طبیعی در عصارههای سلولی زنوپوس غیرضروری است، اما برای نقطهی بررسی صحت میکروتوبول در طول میتوز لازم است.MAPK ها جنبه های متعددی از وظایف میکروتوبول را در هر دو تقسیم میتوزی و میوزی سلولهای جانوری تنظیم می کنند. یافته ها نشان می دهند که MAPKها به خاطر فسفریله کردن پروتئینهای وابسته به میکروتوبول و تنظیم دینامیک میکروتوبول با میکروتوبولها در ارتباط هستند. با بهره گرفتن از آنتیبادیهای اختصاصی برای MAPKهای فعال، محققین [۴۰]ERK1 و ERK2 را در ساختارهای مختلف میتوزی شناسایی کرده اند، که در کینتوکورها زمانی که برخی از کروموزومها در فرایند همترازی (alignment)، در سانتروزومها در سراسر مرحله میتوز شرکت می کنند، و در جسم میانی در طی سیتوکینز، وجود دارند. بنابراین، ERK1 و ERK2 در چندین مرحله در طول تقسیم میتوزی نقش دارند (Bögre et al., ۱۹۹۹). MAPKهای گیاهی بیشترین همولوژی را با زیر خانواده ERK دارند (Jonak et al., ۲۰۰۲).
افرایش میزان mRNA MAP کیناز ۱ (MMK1) در فاز G2 چرخهی سلولی سلولهای یونجه نشان میدهد که این MAPK احتمالا در کنترل چرخهی سلولی دخیل میباشد، اما مشخص نشده است که آیا این MAPK در این سلولها نیز فعال است. میزان بالای بیان MEKK ,NPK1 توتون در تکثیر سلولها نیز به امکان دخالت در کنترل چرخهی سلولی اشاره دارد. همچنین یافت شده است که(Nicotiana Protein Kinase 1) NPK1 در یک مسیر سیگنالی که بیان ژن القاء شده توسط اکسین را مهار می کند، دخالت دارد. .(Bögre et al., ۱۹۹۹)
۱-۴-۳ ژن حساس به اکسین
هورمونها مولکولهای سیگنالی سیستمیکی هستند که نقش کلیدی را در رشد و نمو گیاهان بازی می کنند. آنها همچنین در شکل گیری رشد و نمو در پاسخ به علائم محیطی از قبیل نور درگیر هستند (Liscum and Reed, 2002). اکسینها اولین هورمونهای گیاهی کشف شده و ایجاد کننده سیگنالهای مهم در تکامل و رشد گیاهان هستند. اکسین در جوانه ها، برگها و میوههای در حال رشد ساخته می شود. ممکن است مقداری اکسین در ریشه نیز ساخته شود اما بیشترین میزان اکسین در جوانه انتهایی گیاه ساخته و به دو شکل فعال و غیر فعال به سایر قسمت های گیاه انتقال مییابد et al., ۲۰۰۶) .(Gururaj
شکل-۱-۱۰ مسیر سیگنالینگ اکسین (Liscum and Reed, 2002).
اکسینها تنظیمکننده های رشد گیاه هستند که چندین فرایند در رشد و نمو گیاه از جمله تقسیم سلولی، طویل شدن سلول، قطبیت سلولی و تمایز سلولی را کنترل می کنند. اکسینها اعمال بینظیری در بافتهای مختلف دارند. به عنوان مثال آنها میتوانند سبب تحریک طویل شدن ساقه، القای تشکیل ریشه جانبی، مهار رشد جوانه جانبی یا تحریک تمایز رشته های آوندی شوند. تنوع عملکردی اکسین نشان میدهد که گیاهان دارای چندین مکانیسم برای درک و پاسخ به این هورمونها بوده و سلولهای مختلف زیر مجموعهها و مقادیر مشخصی از اجزای پاسخدهی و درککننده اکسین را دارا میباشند (Walker (and Estell, 1998 . اخیرا به طور چشمگیری، گزارش شده است که اکسین به طور گستردهای به عنوان تنظیمکننده رشد گیاه شناخته شده و همچنین در پاسخ به تنش شرکت می کند. بیشتر علائم مشاهده شده در گیاهان آالوده یا تحت تنش کاهش رشد و تغییر متابولیسم را نشان می دهند. علاوه بر این، ژنهای تنظیم شده با اکسین در گیاهان آلوده به پاتوژن تحت تاثیر قرار میگیرند. این مشاهدات پیشنهاد می کند که اکسین در سازگاری گیاهان به تنشهای زیستی و غیرزیستی دخیل میباشد .(Park et al., ۲۰۰۷)
Genetics
Environment
Hormones and Growth Regulators
Growth and Development
شکل-۱-۱۱- رشد گیاه توسط هورمونها وتنطیمکننده های رشد تنظیم می شود.
رشد و نمو طبیعی گیاه و همچنین سازگاری با تغییرات شرایط محیطی، نیازمند تنظیم دقیق بیان ژن است. برای هر یک از پاسخهای عوامل تغییر (القایی)، ژنهای پاسخدهنده اولیه و تاخیری میتوانند شناسایی شوند. ژنهای اولیه، ژنهایی هستند که به محرکهای القایی و نسبتا سریع (بین ۵ و ۱۵ دقیقه بعد از القا) پاسخ می دهند. به طور طبیعی، این ژنها به محصولات سایر ژنها نیاز دارند. برای به دست آوردن پاسخ بهینه، ژنها در سطوح مختلفی تنظیم میشوند. بسیاری از ژنهای اولیه عمدتا در سطح رونویسی تنظیم میشوند. تنظیم رونویسی در سطح DNAژنومی صورت میگیرد. تنظیم پس از رونویسی می تواند به عنوان یک سطح اضافی از تنظیم مورد نیاز برای افزایش انعطافپذیری و سرعت پاسخهایی دیده شود که فراتر از آن هستند که بهتنهایی از طریق تنظیم رونویسی کسب شوند. چنین تنظیمی عمدتا از طریق کنترل پایداریmRNA رخ میدهد. به علاوه، تنظیم بیان ژن می تواند در سطح ترجمهای یا پس از ترجمهای صورت گیرد. در مورد تنظیم ترجمهای، آغاز ترجمه معمولا تحت تاثیر قرار گرفته، در حالی که کنترل پس از ترجمهای برای پروتئولیز نشان داده شده است. تا به امروز چندین ژن از خانواده ژنومی شناسایی شده اند که میزان بیان آنها نسبت به اکسین تغییر می کند. در بسیاری از موارد، این ژنها نه تنها به اکسین پاسخ می دهند بلکه به سایر عوامل القاکننده نیز پاسخ می دهند. از سوی دیگر، تغییر در بیان ژن اولیه ممکن است منجر به پاسخ فیزیولوژیکی، ایجاد اشکال در تفکیک بین تغییر در بیان ژن تاخیری ایجاد شده توسط اکسین و تغییر بیان ناشی از پاسخهای فیزیولوژیکی شود. چندین گروه از ژنهای حساس به اکسین شناسایی شده اند و آنها به صورت مستقیم یا غیر مستقیم به اکسین پاسخ می دهند (Ogbourne and Antalis, 1998). در سالهای اخیر، پیشرفتهای قابلتوجهی در روشنساختن مسیر Signal transduction اکسین صورت گرفته است.
در یک مدل جدید، اکسین بیان ژن و در نتیجه برآیند رشد و نمو را توسط فراوانی پروتئینهای مهارکننده رونویسی خانواده AUX/IAA تحت تاثیر قرار میدهد. AUX/IAها گمان میرود که توسط هترودایمریزه کردن و در نتیجه تغییر فعالیت فاکتورهای پاسخدهی به اکسین (ARFs) رونویسی را تنظیم می کنند. مطالعات متعدد ژنتیکی و بیوشیمیایی نشان دادهاند که انواع پاسخهای اکسین توسط دو خانواده بزرگ پروتئین به نام پروتئینهای ARF و AUX/IAA تنظیم میشوند. ARF ها بهواسطه اتصال به عناصر پاسخدهی به اکسین حفاظتشده در پروموتورهای ژنهای تنظیم شده با اکسین از جمله کدکننده های AUX/IAA رونویسی را تنظیم می کنند. بنابراین تعادل AUX/IAAها وARF ها یک نقطه کنترل کلیدی در سیگنالینگ اکسین بوده و این به خواص دینامیکی آنها برمیگردد. اکسین تعادل را با تحریک پروتئولیز به واسطه یوبیکوئیتین پروتئینهای AUX/IAA از طریق یوبیکوئیتین لیگاز SCFTIR1 تغییر میدهد و این فیدبک برای تنظیم رونویسی AUX/IAA میباشد. اهمیت این مکانیسم در آنالیزهای ژنتیکی مشهود است (Liscum and Reed, 2002).
شکل-۱-۱۲- شمایی از ترارسانی علامت (Signal transduction) و تنظیم رشد گیاه.
روشهای تجربی بیوشیمیایی، مولکولی و ژنتیکی شواهد اولیهای را نشان می دهند که هردوی پروتئینهای ARF و AUX/IAA به عنوان عوامل رونویسی در ژنهای اولیه پاسخ به اکسین عمل می کنند. این اطلاعات نشان میدهد که میانکنش احتمالی بین ARFها و بین ARFها و AUX/IAA وجود دارد. همچنان که در بالا ذکر شد شواهدی وجود دارد که برخی از ARFها فعالکننده بوده و سایر ARFها مهارکنندهی ژنهای حساس به اکسین هستند. اطلاعات اضافی در مورد پروتئینهای AUX/IAA (به عنوان مثال، بیان بیش از حد پروتئینهای AUX/IAA در سیستمهای سنجش گذرا) دلالت بر این دارد که پروتئینهای AUX/IAA به عنوان مهارکننده ژنهای حساس به اکسین عمل می کنند (Hagen and (Guilfoyle, 2002.
هماکنون شواهد قوی وجود دارد که تنظیم بیان ژن اکسین تحتتاثیر سایر مسیرهای سیگنالی قرار میگیرد. این شواهد عمدتا از خصوصیات موتانتهای پاسخدهی به اکسین به دست آمده است و نشان می دهند که سیگنالینگ اکسین بهواسطه تخریب پروتئین از طریق مسیر پروتئازوم/ یوبی کوئیتین، فسفریلاسیون پروتئین، نور و سایر هورمونها تحتتاثیر قرار میگیرد (Hagen and Guilfoyle, 2002) .
در این پژوهش، سعی شده است اثر تنش خشکی روی بیان چندین ژن مهم دخیل در مسیر ترارسانی علامت بررسی شود.
شناسایی ژنهای جدید، آنالیز الگوهای بیانی آنها در پاسخ به این تنشها و ارزیابی اعمال بالقوه آنها در سازگاری با تنش، استراتژی مهندسی موثری برای بهبود تحمل محصولات به تنش به ما ارائه خواهد داد. علاوه بر این، ارتباط بین فرایندهای زیستی گیاه در سطح فیزیولوژیک و ژنتیک نیز در این پژوهش مورد بحث قرار گرفته است.
.
فصل دوم :
مواد و روشها
۲-۱ شرایط رشد
برای رشد گیاهان از تکنیک کشت بافت (Tissue Culture) استفاده شد. بذرهای گیاه کلزا (B.napus) رقم اکاپی (Okapi) حساس به خشکی و رقم زرفام (Zarfam) مقاوم به خشکی از موسسهی تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج بخش دانه های روغنی تهیه گردید. ابتدا بذرها با بهره گرفتن از اتانول ۷۰ درصد به مدت ۲ دقیقه و سپس با Bleach (هیپوکلریت سدیم) ۲۰ درصد به مدت ۱۰ دقیقه استریل و در نهایت ۴ بار با آب دیونیزه شستشو شدند. بذرهای استریل شده به محیط MS پایه (Murashige & skoog basal medium) نیممرتبه (half-strength) تهیه شده از شرکت سیگما آمریکا ((Sigma M5519 با ۸/۵ pH=حاوی ۸/۰ درصد آگار (Plant agar, Sigma) منتقل شده و سپس به مدت ۸ روز در اتاق رشد تحت شرایط ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد با شدت نور µmol/m2.s2000 قرار گرفتند.
شکل-۲-۱- تصویر گیاهچههای کلزا.
۲-۱-۱ نحوه تیماردهی گیاهان
گیاهچههای (Seedlings) 8 روزهی کلزا به مدت ۲۴ ساعت و در سه دوره زمانی در معرض تنش خشکی قرار گرفتند. در مطالعه حاضر، به منظور اعمال تنش خشکی، گیاهچهها تحت تیمار مانیتول (Mannitol) 200 میلیمولار قرار گرفته و به ۴ گروه تقسیم شدند:
گیاهان شاهد (Control): به این گروه مقدار ۴۰ میلی لیتر محلول MS (بدون آگار) در زیر هود لامینار و در شرایط کاملا استریل اضافه شده و سپس به مدت ۲۴ ساعت بر روی شیکر (Shaker) قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۳ ساعت (۳h): این گیاهان به مدت ۳ ساعت به منظور اعمال تنش خشکی، تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این دسته، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۳ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۱۲ ساعت (۱۲h): این گروه به مدت ۱۲ ساعت تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این دسته، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۱۲ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۲۴ ساعت (۲۴h): این گیاهان به مدت ۲۴ ساعت تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این گروه، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۲۴ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی (CRD)[۴۱] با ۴ تیمار و هر تیمار در ۳ تکرار انجام گردید.
۲-۱-۲ برداشت نمونه
۲-۱-۲-۱ برداشت نمونه جهت انجام بررسیهای مولکولی
پس از پایان تیمار تنش خشکی، به ترتیب طی زمانهای صفر (شاهد)، ۳، ۱۲ و ۲۴ ساعت، شیشههای حاوی گیاهچهها را از روی شیکر برداشته و پس از خارج ساختن گیاهچهها و آبگیری، آنها را در داخل فویل آلومینیومی قرار داده و بلافاصله در ازت مایع منجمد و در نهایت در فریزر ۸۰- درجه سانتی گراد موجود در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه نگهداری شدند.
۲-۱-۲-۲ برداشت نمونه جهت انجام بررسیهای فیزیولوژیک
نمونهبرداری از کل Seedling انجام گرفت. پس از پایان تیمار تنش خشکی، به ترتیب طی زمانهای صفر (شاهد)، ۳، ۱۲ و ۲۴ ساعت، شیشههای حاوی گیاهچهها را از روی شیکر برداشته و پس از خارج ساختن گیاهچهها و آبگیری، آنها را در داخل فویل آلومینیومی قرار داده و بلافاصله به فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد موجود در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه انتقال داده شدند. جهت تعیین وزن خشک برای برخی آزمایشات که نیاز به وزن خشک نمونهها داشت، ریشهها و ساقهها در آون ۸۰ درجه سانتی گراد به مدت ۴۸ ساعت قرار گرفتند. وزن خشک با ترازویی با حساسیت ۰۰۰۱/۰ گرم اندازه گیری شد.
۲-۲ روشهای بکار گرفته شده در آزمایشات مولکولی
۲-۲-۱ پودر کردن و آماده سازی نمونه جهت استخراج RNA
نمونههای گیاهی در هاون حاوی نیتروژن مایع کوبیده شدند تا بخوبی پودر شوند. این عمل برای از بین بردن دیواره سلولی و غشای پلاسمایی نمونهها انجام میگیرد تا استخراج RNA کل آنها قابل انجام باشد. نمونههای پودر شده وارد لولههای Eppendorf 15 میلی لیتری شده و تا زمان انجام آزمایش در فریزر ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری شدند. به این ترتیب دارای ۸ گروه نمونه پودر شده هستیم که شامل ۴ سری از رقم اکاپی و ۴ گروه از رقم زرفام میباشند.
۲-۲-۲ استخراج RNA از بافت گیاهی
حدود ۲۰۰ میلی گرم از بافت نمونه مورد نظر در۵۰۰ میکرو لیتر Trizol® داخل تیوب (tube) 5/2 میلی لیتر ریخته و مخلوط بخوبیvortex گردید. سپس ۵۰۰ میکرو لیتر دیگر Trizol® به آن اضافه و دوباره مخلوط را vortex کرده و بمدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند.
۲۰۰ میکرولیتر کلروفرم به آن اضافه شده و مخلوط به خوبی vortex گردید.
مخلوط حاصل به مدت ۱۵ دقیقه در دور g14000 در دمای cº۴ با دستگاه سانتریفوژ ساخت شرکت eppendorf آلمان سانتریفوژ شدند.
مایع شفاف بالایی توسط پیپت از رسوبات کف تیوب جدا شده و به تیوب دیگری انتقال یافت.
۵۰۰ میکرو لیتر ایزوپروپانول به آن اضافه شده و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت.
محتوای تیوبها دور ریخته می شود و پلیتهای به جا مانده در کف تیوبها با ۱۵ میلی لیتر اتانول ۷۰% شسته شدند.
پس از آن تیوبها به مدت ۱ دقیقه در دمای cº۴ سانتریفوژ گشتند.
موضوعات: بدون موضوع
لینک ثابت