۴)درب این لوله ها محکم بسته شد و در دمای اتاق و در تاریکی نگهداری گردید .
۵)استاندارد سولفات باریوم قبل از هر بار استفاده باید به شدت (ترجیحاً با ورتکس مکانیکی ) همزده شود ، تا کدورت یکنواختی ایجاد گردد . در صورت مشاده ذرات بزرگ ، باید استاندارد تازه ای تهیه گردد.
۶)استاندارد سولفات باریوم باید به صورت ماهانه جایگزین شود یا جذب آن اندازه گیری گردد.
برای مقایسه با کدورت نیم مک فارلند باید سوسپانسیون باکتریایی و استاندارد تهیه شده با یکدیگر در مقابل صفحه ای با خطوط تیره بررسی شوند.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۱۴-۲- آماده سازی باکتری‌ها
۱) باکتری‌های مورد نظر را پس از خارج کردن از حالت منجمد در محیط کشت مایع نوترین براث استریل کشت داده شدند.
۲) باکتری‌های کشت شده در محیط مایع را به مدت ۲۴ ساعت جهت رشد در انکوباتور ۳۷ نگه‌داری گردیدند.
۳) سپس باکتری‌های موجود در محیط مایع را تا زمان کشت دادن روی محیط جامد نوترین آگار در دمای ۴ نگه‌داری شدند.
البته این مدت زمان نباید زیاد طولانی باشد، زیرا کشت کهنه شده و قدرت رشد باکتری‌های برای محیط جامد کاهش خواهد یافت.
۲-۱۴-۳- آماده سازی نمونه‌های پروتئینی استری شده
تمامی نمونه‌های پروتئینی استری شده را جهت تهیه محلول پروتئینی ۵/۰ درصد در تیوب‌های کوچک توزین نموده و توسط آب دو با تقطیر به حجم موردنظر رسانیده شدند.
۲-۱۴-۴- روش انجام آزمون ضدباکتریایی
۱) ابتدا مقداری کاغذ صافی را به شکل دایره‌هایی با قطر تفریبی ۵/۰ میلی‌متر برش زده شدند.
۲) پنس و کاغذ صافی‌های برش داده شده را با دقت توسط اتوکلاو استریل شدند.
۳) محیط کشت‌های جامد نوترین آگار ریخته شده در پلیت را که از قبل آماده شده‌اند در زیر هودی که از قبل استریل شده است قرار گرفتند.
۴) نمونه‌های باکتریایی را که در مرحله آماده سازی باکتری در محیط کشت مایع رشد داده‌ایم به زیر هود انتقال داده شدند.
۵) محلول‌های ۵/۰ درصد پروتئینی را که از قبل آماده کرده‌ایم به زیر هود منتقل شدند.
۶) باکتری‌های آماده شده در محیط کشت مایع را بر روی محیط کشت جامد به وسیله لوپ کشت، کشت چمنی داده شدند.
در این مرحله باید از دستکش استفاده گردد و سطح دستکش قبل از شروع به کار با اتانل ۷۰% باید استریل گردد. بعد از هر بار گشت دادن لوپ را توسط شعله استریل می‌کنیم و تمامی مراحل کشت دادن باید نزدیک به شعله انجام شود.
۷) بعد از گذشت ۳۰ دقیقه که باکتری‌ها بر روی محیط کشت تثبیت شدند، به آرامی کاغذ صافی‌های برش زده شده را توسط پنس به محلول پروتئینی مورد نظر آغشته نموده و بر روی محل علامت‌گذاری شده قرار گرفتند.
در این مرحله باید دقت کرد تا سر پنس با سطح محیط کشت تماس برقرار نکرده و موجب پارگی آن نشود.
۸) جهت تثبیت شدن کامل پروتئین آغشته شده به کاغذ صافی، بعد از قرار دادن آن بر روی محل مورد نظر به مدت ۱ ساعت آن را به همان حال خود رها شدند.
۹) محیط‌های کشت را به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت درون انکوباتور ۳۷ نگه‌داری کرده و نتیجه را ثبت کردیم.
در صورتی که پروتئین اثر ضدباکتریایی داشته باشد، یک هاله عدم رشد اطراف کاغذ صافی مشاهده می‌شود.
فصل سوم
نتایج
۳-۱- نتایج حاصل از خالص‌سازی BLG
۳-۱-۱- خالص‌سازی ابتدایی
طبق مراحلی که در فصل دوم شرح آن‌ها داده شد، خالص‌سازی با بهره گرفتن از روش آرمسترانگ و همکاران انجام پذیرفت. نمک مورد استفاده در این روش آمونیوم‌سولفات بود که با به کار بردن غلظت‌های تدریجی آن، پروتئین‌ها را به ترتیب رسوب داده تا به رسوبی از BLG با کمترین مزاحمت ایجاد شده توسط دیگر پروتئین‌ها دست یابیم. اولین رسوب به دست آمده در این بخش پس از افزودن بخش اول نمک آمونیوم‌سولفات حاوی چربی و مقداری کازئین خواهد بود و پس از صاف شدن، محلول باقی مانده () همان آب پنیر خواهد بود. پس از رساندن pH محلول به ۵/۳ رسوبی به دست خواهد آمد(a2) که حاوی مقدار زیادی آلفالاکتالبومین و کازئین خواهد بود و بدین ترتیب ما دیگر پروتئین‌های مزاحم را هم حذف
کرده‌ایم. محلول به دست آمده در این مرحله (a3) حاوی مقدار بسیار زیادی BLG است که با افزودن مقدار دوم نمک آمونیوم‌سولفات آن را رسوب داده و جهت دیالیز آماده می‌کنیم.
در تمامی مراحل این روش خالص‌سازی، SDS-PAGE انجام می‌شود تا از روند پیشرفت کار و میزان خالص شدن BLG اطلاع حاصل گردد. همانطور که در شکل ۳-۱مشاهده می‌کنید میزان پروتئین‌های مزاحم به ترتیب در رسوب‌های a2، a3 و رسوب نهایی BLG کاهش می‌یابد و به خلوص قابل قبولی از این پروتئین دست می‌یابیم.
aLAC
BLG
casein
BLGخالص
رسوب BLG
۳a
۲a
شکل ۳-۱ تصویر SDS-PAGE از BLG خالص، رسوب BLG بسیار خالص شده، رسوب a2 و رسوب a3.
همانطور که در شکل ۳-۱ واضح است، در رسوب‌ به دست آمده a2 مقدار زیادی کازئین و آلفالاکتالبومین اضافی داریم که بخش اعظمی از کازئین و مقدار بسیار زیادی از آلفالاکتالبومین در رسوب a3 حذف شده است و در رسوب BLG مشاهده می‌شود که این دو پروتئین عمده آب پنیر حذف شده‌اند و گامی مثبت در جهت خالص‌سازی BLG است. لذا BLG به دست آمده در این مرحله تا حدود زیادی خالص است.
۳-۱-۲- افزایش غلظت BLG
به منظور افزایش غلظت BLG جهت برآورد بهتر اثر آن اقدام به تغلیظ بهتر نمونه پروتئینی گردید. جهت این کار از دیالیز نمونه پروتئینی حل شده در بافر پروتئینی استفاده شد.
شکل ۳-۲ تصویر SDS-PAGE نمونه BLG دیالیز شده با غلظت بالاتر
همانطور که در شکل ۳-۲ مشاهده می‌کنیم، دیالیز صورت گرفته در برابر بافر استات غلظت BLG محلول را بسیار افزایش داده و درصد خلوص بسیار بالا و قابل قبولی را فراهم کرده‌ است که این میزان خلوص و نحوه به دست آوردن آن مطابق آن چیزی بود که مورد نیاز است.
۳-۲- نتایج BLG استری شده
۳-۲-۱- نتایج ژل SDS-PAGE از BLG استری شده
از آن جایی که واکنش استری کردن در محیط خود دارای اسید و عوامل واکنش‌گر دیگر می‌باشد، جهت اطمینان از عدم هیدرولیز شدن این پروتئین، با نمونه‌های استری شده SDS-PAGE را انجام شد تا در مراحل بعدی این اطمینان حاصل شود که اثر دیده شده مربوط به پروتئین کامل است و نه پپتیدهای آن.
همانطور که در شکل ۳-۳ مشاهده می‌کنید، هیچ اثری از هیدرولیز شدن پروتئین در SDS-PAGE این نمونه‌ها مشاهده نمی‌شود.
۳-۲-۲- نتایج ژل UREA-PAGE پروتئین‌های استری شده
PAGE UREA- تفاوت بارها را نشان می‌دهد. این روش به دلیل داشتن اوره و نداشتن SDS پروتئین‌ها را بر حسب بار و اندازه‌اشان جداسازی می‌کند. قبل از انجام هر تستی این روش جهت اطمینان از استری شدن نمونه‌ها انجام می‌شود.
همانطور که در شکل ۳-۴، مشاهده می‌کنید باندها در یک منطقه جمع نشده‌اند و دارای اسمیر هستند. دلیل آن این است که تغییر بار در این پروتئین‌ها به صورت همگن اتفاق نمی‌افتد و هر کدام در منطقه‌ای از ژل متوقف می شوند و این خود اثبات استری شدن پروتئین‌هاست. دو نمونه BLG استری شده توسط متانل و اتانل، همانطور که مشاهده می‌کنید باند تشکیل نداده‌اند که دلیل آن استری شدن بسیار این پروتئین توسط این الکل‌ها و عدم ورودشان به ژل می‌باشد.