ابتدا باید عصاره گیری از طریق خوابانیدن در حلال متانول غلیظ مرک انجام شود. پس از خشک‌کردن گیاه در شرایط دمای اتاق یا آزمایشگاه و در سایه، گیاه با بهره گرفتن از آسیاب معمولی، پودر شده و مقدار ۱ گرم پودر به ۱۰ میلی‌لیتر متانول اضافه شد و به همین ترتیب به نسبت ۱ به ۱۰ به مدت ۲۴ ساعت قرار داده شد و سپس بعد از ۲۴ ساعت از کاغذ صافی عبور داده شده و محلول زیر صافی روتاری گردید.(دمای روتاری باید حدود ۶۰ درجه یعنی دمای جوش متانول باشد). در این زمان چون به وسیله روتاری دما به دمای جوش متانول رسانیده شد، متانول تبخیر شده و در ظرفی جداگانه وارد گردید و آنچه باقی ماند عصاره خالص بود (تغلیظ انجام شد و تا آن حدی که نیاز داریم متانول تبخیر می‌شود) و این بستگی به هدف ما در خصوص میزان غلظت عصاره دارد که اگر بخواهیم کامل تغلیظ شود متانول کامل تبخیر می‌شود.( تغلیظ برای این است که ماده موثره را استخراج کنیم).

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۷-۱-۳- اندازه گیری فنل کل فراسیون توسط روش Follin-Ciocalteu
برای اندازه گیری فنل کل در این آزمایش از روش ابراهیم زاده و همکاران استفاده شد. در این روش ابتدا ۴۰ میلی‌گرم عصاره خشک شده در ۲۵ میلی‌لیتر متانول مرک حل شد و ۵/۰ میلی‌لیتر از این عصاره متانولی را با ۵ میلی‌لیتر فولین سیوکالتیو (۱ به ۱۰ رقیق شود با آب مقطر) و ۴ میلی‌لیتر کربنات سدیم یک مولار (۶/۱۰ گرم در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر) و برای ساختن شاهد ۵/۰ میلی‌لیتر متانول مرک را با ۵ میلی‌لیتر فولین سیوکالتیو (۱ به ۱۰ رقیق شود با آب مقطر) و با ۴ میلی‌لیتر کربنات سدیم ترکیب شد و ۱۵ دقیقه در تاریکی و با دستگاه اسپکتوفتومتر، طول موج ۷۶۵ نانومتر خوانده شد و برای ساختن استاندارد گالیک اسید از غلظت‌های ۰، ۵۰، ۱۰۰، ۱۵۰، ۲۰۰، ۲۵۰ میلی‌گرم بر لیتر در متانول مرک استفاده شد و در برنامه آماری نمودار خطی رسم شد و معادله خط نیز به دست آمد. (y = 0.0063x, r² = ۰٫۹۸۷).
و جذب نمونه‌ها را به جای Y گذاشته و X فنل کل است که بایستی آن را بدست آوریم و ما آن را برای برای ۱ گرم در لیتر باید حساب کنیم و واحد فنل کل mg gallic acid equivalent/g می‌باشد(شکل ۳-۹).
شکل ۳-۹ مراحل اندازه گیری فنل
۳-۷-۱-۴- عصاره‌گیری پلی فنل‌ها
ابتدا گیاه خشک شده را با آسیاب برقی پودر کرده واز الک بسیار ریز رد کردیم. به اندازه ۲/۰گرم از آن را اندازه گیری و داخل میکروتیوپ ریخته می‌شود، سپس حلال ۸۵/۰ متانول + ۱۵/۰ اسید استیک را با هم مخلوط کرده و به مقدار ۱۰ برابر مقدار نمونه، روی نمونه گیاه ریخته، که ۲ سی سی می‌شود. سپس داخل میکروتیوپ را از گاز ازت پر کرده تا هوایی داخل آن نباشد چون اگر هوا باشد باعث اکسیده شدن ترکیبات می‌شود.
سپس نمونه ها را داخل فویل پوشانده که نور نبیند، چون ترکیبات پلی فنلی به نور حساس اند. سپس به مدت ۲۴ ساعت در یخچال نگه‌داری می‌شود تا نمونه ها کاملاً با محلول بماند و خیس بخورد. بعد از ۲۴ ساعت نمونه‌ها را از یخچال در آورده و همراه با فویل پوشیده شده در دستگاهUltrasonic cleaner قرار داده تا با ضربه‌های مغناطیسی که به گیاه وارد کرده، ترکیبات پلی فنلی بهتر و بیش تر از بافت گیاه جدا و وارد حلال شوند، محلول را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای کاملاًپایین در این دستگاه قرار می‌دهیم.
سپس نمونه‌ها را از این دستگاه و از فویل خارج کرده در سانتریفیوژ یخچال دار با دمای ۰ درجه و ۱۰۰۰۰ دور به مدت ۲۰ دقیقه قرار داده تا فاز مایع از جامد جدا شود. نمونه‌ها را از دستگاه خارج کرده که ایجاد دو فاز کرده، فاز رویی را جدا کرده و دور ریختیم و روی بقیه را ان هگزان ریخته و روی ورتکس قرار دادیم که کاملاً حل گردند، و دوباره به مدت ۱۰ دقیقه و دمای ۰ درجه و دور ۱۰۰۰۰ درون سانتریفیوژ یخچال دار قرار دادیم که دوباره ایجاد دو فاز می کند. فاز رویی کلروفیل + پروتئین + چربی بوده و فاز زیرین پلی فنل می‌باشد.
سپس با سرنگ، پلی فنل زیرین را کشیده و به سر سرنگمان صافی سر سرنگی زده تا کاملاً نا خالصی‌ها گرفته شود سپس داخل شیشه‌های مخصوص HPLC ریخته، که آماده تزریق به دستگاه می‌باشد.
۳-۷-۲- اندازه گیری خاصیت آنتی اکسیدانی
۳-۷-۲-۱- مواد و وسایل لازم
کوئرستین، گالیک اسید، ویتامین E، پیپت، سرنگ همیلتون، پیپتور، لوله آزمایش، سِل، استون، آب مقطر، متانول
۳-۷-۲-۲- شرح کار:
ابتدا میزان gr 25/. از ماده خشک از هر سه گیاه (رویش یافته در مناطق استهبان، زرین دشت و نیریز) به طور جداگانه پودر کرده و داخل فالکون ریخته سپس میزان cc 10 استون ۸۰% اضافه می‌شود. برای جلوگیری از نور، فالکون حاوی مواد را داخل فویل پیچیده و به مدت ۱ ساعت در دمای محیط قرار داده و سپس نمونه‌ها به مدت ۱۰دقیقه با سرعت ۳۵۰۰ دور در ثانیه سانتریفیوژ ‌شد.
پس از آن محلول گالیک اسید، ویتامین E و کوئرستین با ۱۱ غلظت و در مدت زمان مشخص به محلول اضافه شد.
شکل ۳-۱۰ اندازه گیری آنتی اکسیدانی
برای اینکه از خطا جلوگیری شود اضافه کردن محلول استاندارد به لوله‌های آزمایش با یک فاصله زمانی معین (۲ دقیقه) انجام شد.
پس از ساخت نمونه‌ها و کالیبره کردن، طول موج نمونه‌ها با اسپکتروفوتومتر در طول موج ۵۱۹ قرائت می‌شود. سپس با تجزیه و تحلیل آماری با بهره گرفتن از میکروپلیت ریدر میزان آنتی اکسیدانی ترکیبات بدست می‌آید (شکل ۳-۱۰).
فصل چهارم
نتایج
۴-۱- درصد اسانس شیره گیاه مرتعی دارویی آنغوزه رویش یافته در سه منطقه استان فارس
عمل اسانس‌گیری برای هر نمونه ۳ بار تکرار گردید. مقادیر بر اساس درصد وزنی به وزنی محاسبه شد و با عنوان درصد اسانس^[۱۰] گزارش گردید.
نتایج این پژوهش نشان داد، که میانگین درصد اسانس آنغوزه رویش یافته در منطقه استهبان(۷۵/۱۳%)، آنغوزه رویش یافته در منطقه زرین دشت(۹۶/۱۲%) آنغوزه رویش یافته در منطقه نیریز(۱۰/۷%) است. تفاوت میانگین اسانس‌های این سه گیاه در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد، مقایسه درصد اسانس این سه گیاه در شکل ۴-۱ آمده است.
a
a
شکل ۴-۱- مقایسه درصد اسانس در گیاه مرتعی-دارویی آنغوزه در سه منطقه مختلف رویشی استان فارس
۴-۲- تجزیه کمی و کیفی اسانس گیاه مرتعی-دارویی آنغوزه در مناطق رویشی استهبان، زرین شت و نیریز
۴-۲-۱- تجزیه کمی و کیفی اسانس گیاه مرتعی-دارویی آنغوزه در منطقه رویشی استهبان
چهل وهفت ترکیب در اسانس آنغوزه در منطقه رویشی استهبان شناسایی شد که در مجموع ۹۵/۹۹%، اسانس را تشکیل دادند. پیک‌های شاخص در کروماتوگرام نشان دهنده ترکیبات عمده تشکیل دهنده اسانس می‌باشند که به‌ترتیب عبارت‌اند از: Z ۱-پروپنیل ۱سیک بوتیل دی سولفید (۹۷/۲۹%)، E ۱-پروپنیل ۱سیک بوتیل دی سولفید (۹۸/۹%)، تبیس(۱متیل متیو)پروپیل دی سولفید (۳۲/۹%)، پ۱۰-اپی جی اُدیسمول(۲۶/۷%)، آلفاپینن (۳۹/۶%)، بتاپینن (۰۵/۶%) و بتا اُسیمن (۳۱/۵%) و E بتا اُسیمن (۳۵/۴%) تعیین شد و درصد اسانس برای آنغوزه رویش یافته در استهبان(۷۵/۱۳%) وزن خشک گیاه به‌دست آمد. کروماتوگرام اسانس آنغوزه رویش یافته در استهبان در نمودار ۴-۱ و ترکیبات عمده آنغوزه رویش یافته در استهبان در جدول ۴-۱ و ترکیب‌های عمده اسانس آنغوزه رویش یافته در استهبان در شکل ۴-۲ نشان داده شده است.
نمودار ۴-۱- کروماتو گرام اسانس گیاه آنغوزه در منطقه استهبان
شکل ۴-۲- ترکیب های عمده تشکیل دهنده اسانس گیاه آنغوزه در منطقه استهبان
جدول ۴-۱- ترکیب‌های تشکیل دهنده اسانس گیاه آنغوزه در منطقه استهبان