۷۲

Extension

۱۰ دقیقه

۷۲

۱

Final extension

۳-۷- تهیه ژل و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

ژل الکتروفورز به صورت زیر تهیه و برای بررسی نتایج آزمون PCR مورد استفاده قرار گرفت.
یک گرم آگاروز در ۱۰۰ میلی لیتر بافر TBE (8/10 گرم تریس، ۵/۵ گرم بوریک اسید، ۷۳/۰ گرم EDTA در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر، ۳/۸=pH) حل و چند دقیقه جوشانده شد. پس از رسیدن دما به ۵۰-۶۰ درجه سانتی گراد، محلول ژل به آرامی درون قالبی که دو طرف آن با چسب مسدود شده بود، ریخته شد.
قبل از انجماد ژل، شانه مخصوص به نحوی در داخل مخلوط ژل فرو برده شد که لایه نازکی از ژل در قسمت‌های زیرین شانه قرار داشته باشد. پس از بستن ژل، چسب‌ها از دو انتهای ژل حذف، شانه به آرامی خارج و ژل همراه قالب خود در محفظه دستگاه الکتروفورز به نحوی قرار داده شد که دو سر آزاد ژل با مخازن بافر در تماس باشد. محفظه الکتروفورز با بافر TBE تا اندازه‌ای پر شد که ارتفاع بافر روی سطح ژل به دو تا سه میلی متر برسد.
۹ میکرولیتر از محصول PCR با ۳ میکرولیتر رنگ کرزول رد (۱۰ میلی مولار کرزول رد حاوی ۱۰ درصد سوکروز) مخلوط و در چاهک‌ها ریخته شد. یک چاهک هم به مارکر اختصاص داده شد. پس از قرار دادن درب محفظه الکتروفورز، ولتاژ دستگاه در ۸۵ ولت تنظیم و به مدت ۱ ساعت الکتروفورز انجام گردید.
پس از اتمام زمان مذکور، رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید صورت گرفت. بعد از رنگبری با آب مقطر، ژل برروی صفحه UV transilluminator مورد بررسی قرار گرفت و با بهره گرفتن از دستگاه gel documentation از آن عکسبرداری شد و با کمک مارکرهای مخصوص اندازه قطعه تکثیر شده تخمین زده شد.
۳-۸- آزمون واکنش زنجیره­ای پلیمراز در زمان واقعی ( RT- PCR , (Real-Time PCR
در این پژوهش از آزمون واکنش زنجیره‌ای پلی مراز در زمان واقعی (RT-PCR) برای تعیین میزان غلظت ویروس در گیاهان مایه‌زنی شده در آزمایش بررسی برهمکنش میان دو گونه BCTIV و BSCTV-IR در ۳ رقم چغندرقند استفاده شد. این آزمون به روش Carrillo-Tripp و همکاران (۲۰۰۷) در دستگاه Line Gene K BIOEER و به روش SYBR® Green و با بهره گرفتن از کیت ۲* Greenstar q PCR Master MIX شرکت BIONEER انجام ­گردید. نوع و مقدار مواد برای هر واکنش مطابق جدول ۳-۵ بود. آغازگرهای BSCTV-IR و BCTIRV ویژه­ی این آزمون و همچنین آغازگر ژن Beet rRNA 18s در چغندرقند به عنوان استاندارد داخلی که توسط طاهری (۱۳۹۱) طراحی شده بود، استفاده شد. کلیه آغازگرهای ویژه­ی آزمون واکنش Real-Time PCR توسط شرکت Metabion آلمان ساخته شدند. مشخصات هر آغازگر و سیکل­های دمایی آزمون واکنش Real-Time PCR در جدول‌های شماره ۳-۶ تا ۳-۹ آمده است.

جدول ۳-۵- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در آزمون واکنش Real-Time PCR

مقدار در هر واکنش ۲۰ میکرولیتری بر حسب میکرولیتر

نوع ماده

۰.۸

Forward Primer ( 10 µM )

۰.۸

Reverse Primer ( 10 µM )

۱۰

Mix buffer (2 X)

۵

DNA template