برای شروع بلوغ اووسیت ها در میوز I که در مرحله ی G2 توقیف شده ­اند و برای ایجاد وقفه در پیشرفت چرخه­ی سلولی در یک مرحله­ متافاز مانند در انتهای میوز II.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

شواهد فراوانی در مورد فعالیت میتوزی خاص MAPKها در سلول­های جانوری وجود دارد. اگرچه، به نظر می­رسد MAPK برای میتوز طبیعی در عصاره­های سلولی زنوپوس غیر­ضروری است، اما برای نقطه­ی بررسی صحت میکروتوبول در طول میتوز لازم است.MAPK ها جنبه­ های متعددی از وظایف میکروتوبول را در هر دو تقسیم میتوزی و میوزی سلول­های جانوری تنظیم می­ کنند. یافته­ ها نشان می­ دهند که MAPKها به خاطر فسفریله کردن پروتئین­های وابسته به میکروتوبول و تنظیم دینامیک میکروتوبول با میکروتوبول­ها در ارتباط هستند. با بهره گرفتن از آنتی­بادی­های اختصاصی برای MAPKهای فعال، محققین [۴۰]ERK1 و ERK2 را در ساختارهای مختلف میتوزی شناسایی کرده ­اند، که در کینتوکورها زمانی که برخی از کروموزوم­ها در فرایند هم­ترازی (alignment)، در سانتروزوم­ها در سراسر مرحله میتوز شرکت می­ کنند، و در جسم میانی در طی سیتوکینز، وجود دارند. بنابراین، ERK1 و ERK2 در چندین مرحله در طول تقسیم میتوزی نقش دارند (Bögre et al., ۱۹۹۹). MAPK­های گیاهی بیشترین همولوژی را با زیر خانواده ERK دارند (Jonak et al., ۲۰۰۲).
افرایش میزان mRNA MAP کیناز ۱ (MMK1) در فاز G2 چرخه­ی سلولی سلول­های یونجه نشان می­دهد که این MAPK احتمالا در کنترل چرخه­ی سلولی دخیل می­باشد، اما مشخص نشده است که آیا این MAPK در این سلول­ها نیز فعال است. میزان بالای بیان MEKK ,NPK1 توتون در تکثیر سلول­ها نیز به امکان دخالت در کنترل چرخه­ی سلولی اشاره دارد. همچنین یافت شده است که(Nicotiana Protein Kinase 1) NPK1 در یک مسیر سیگنالی که بیان ژن القاء شده توسط اکسین را مهار می­ کند، دخالت دارد. .(Bögre et al., ۱۹۹۹)
۱-۴-۳ ژن حساس به اکسین
هورمون­ها مولکول­های سیگنالی سیستمیکی هستند که نقش کلیدی را در رشد و نمو گیاهان بازی می­ کنند. آنها همچنین در شکل­ گیری رشد ­و­ نمو در پاسخ به علائم محیطی از قبیل نور درگیر هستند (Liscum and Reed, 2002). اکسین­ها اولین هورمون­های گیاهی کشف شده و ایجاد کننده سیگنال­های مهم در تکامل و رشد گیاهان هستند. اکسین در جوانه­ ها، برگها و میوه­های در حال رشد ساخته می­ شود. ممکن است مقداری اکسین در ریشه نیز ساخته شود اما بیشترین میزان اکسین در جوانه انتهایی گیاه ساخته و به دو شکل فعال و غیر فعال به سایر قسمت­ های گیاه انتقال می­یابد et al., ۲۰۰۶) .(Gururaj

شکل-۱-۱۰ مسیر سیگنالینگ اکسین (Liscum and Reed, 2002).
اکسین­ها تنظیم­کننده­ های رشد گیاه هستند که چندین فرایند در رشد ­و ­نمو گیاه از جمله تقسیم سلولی، طویل شدن سلول، قطبیت سلولی و تمایز سلولی را کنترل می­ کنند. اکسین­ها اعمال بی­نظیری در بافت­های مختلف دارند. به عنوان مثال آنها می­توانند سبب تحریک طویل شدن ساقه، القای تشکیل ریشه جانبی، مهار رشد جوانه جانبی یا تحریک تمایز رشته­ های آوندی شوند. تنوع عملکردی اکسین نشان می­دهد که گیاهان دارای چندین مکانیسم برای درک و پاسخ به این هورمون­ها بوده و سلول­های مختلف زیر مجموعه­ها و مقادیر مشخصی از اجزای پاسخ­دهی و درک­کننده اکسین را دارا می­باشند (Walker (and Estell, 1998 . اخیرا به­ طور چشمگیری، گزارش شده است که اکسین به طور گسترده­ای به عنوان تنظیم­کننده رشد گیاه شناخته شده و همچنین در پاسخ به تنش شرکت می­ کند. بیشتر علائم مشاهده شده در گیاهان آالوده یا تحت تنش کاهش رشد و تغییر متابولیسم را نشان می­ دهند. علاوه بر این، ژن­های تنظیم شده با اکسین در گیاهان آلوده به پاتوژن تحت تاثیر قرار می­گیرند. این مشاهدات پیشنهاد می­ کند که اکسین در سازگاری گیاهان به تنش­های زیستی و غیرزیستی دخیل می­باشد .(Park et al., ۲۰۰۷)
Genetics
Environment
Hormones and Growth Regulators
Growth and Development
شکل-۱-۱۱- رشد گیاه توسط هورمون­ها وتنطیم­کننده­ های رشد تنظیم می­ شود.
رشد ­و ­نمو طبیعی گیاه و همچنین سازگاری با تغییرات شرایط محیطی، نیازمند تنظیم دقیق بیان ژن است. برای هر یک از پاسخ­های عوامل تغییر (القایی)، ژن­های پاسخ­دهنده اولیه و تاخیری می­توانند شناسایی شوند. ژن­های اولیه، ژن­هایی هستند که به محرک­های القایی و نسبتا سریع (بین ۵ و ۱۵ دقیقه بعد از القا) پاسخ می­ دهند. به طور طبیعی، این ژن­ها به محصولات سایر ژن­ها نیاز دارند. برای به دست آوردن پاسخ بهینه، ژن­ها در سطوح مختلفی تنظیم می­شوند. بسیاری از ژن­های اولیه عمدتا در سطح رونویسی تنظیم می­شوند. تنظیم رونویسی در سطح DNAژنومی صورت می­گیرد. تنظیم پس از رونویسی می ­تواند به عنوان یک سطح اضافی از تنظیم مورد نیاز برای افزایش انعطاف­پذیری و سرعت پاسخ­هایی دیده شود که فراتر از آن هستند که به­تنهایی از طریق تنظیم رونویسی کسب شوند. چنین تنظیمی عمدتا از طریق کنترل پایداریmRNA رخ می­دهد. به علاوه، تنظیم بیان ژن می ­تواند در سطح ترجمه­ای یا پس از ترجمه­ای صورت گیرد. در مورد تنظیم ترجمه­ای، آغاز ترجمه معمولا تحت تاثیر قرار گرفته، در حالی که کنترل پس از ترجمه­ای برای پروتئولیز نشان داده شده است. تا به امروز چندین ژن از خانواده ژنومی شناسایی شده ­اند که میزان بیان آنها نسبت به اکسین تغییر می­ کند. در بسیاری از موارد، این ژن­ها نه تنها به اکسین پاسخ می­ دهند بلکه به سایر عوامل القا­کننده نیز پاسخ می­ دهند. از سوی دیگر، تغییر در بیان ژن اولیه ممکن است منجر به پاسخ فیزیولوژیکی، ایجاد اشکال در تفکیک بین تغییر در بیان ژن تاخیری ایجاد شده توسط اکسین و تغییر بیان ناشی از پاسخ­های فیزیولوژیکی شود. چندین گروه از ژن­های حساس به اکسین شناسایی شده ­اند و آنها به صورت مستقیم یا غیر مستقیم به اکسین پاسخ می­ دهند (Ogbourne and Antalis, 1998). در سال­های اخیر، پیشرفت­های قابل­توجهی در روشن­ساختن مسیر Signal transduction اکسین صورت گرفته­ است.
در یک مدل جدید، اکسین بیان ژن و در نتیجه برآیند رشد و نمو را توسط فراوانی پروتئین­های مهارکننده رونویسی خانواده AUX/IAA تحت تاثیر قرار می­دهد. ­­­AUX/IAها گمان می­رود که توسط هترودایمریزه کردن و در نتیجه تغییر فعالیت فاکتورهای پاسخ­دهی به اکسین (ARFs) رونویسی را تنظیم می­ کنند. مطالعات متعدد ژنتیکی و بیوشیمیایی نشان داده­اند که انواع پاسخ­های اکسین توسط دو خانواده بزرگ پروتئین به نام پروتئین­های ARF و AUX/IAA تنظیم می­شوند. ARF ها به­واسطه اتصال به عناصر پاسخ­دهی به اکسین حفاظت­شده در پروموتورهای ژن­های تنظیم شده با اکسین از جمله کد­کننده­ های AUX/IAA رونویسی را تنظیم می­ کنند. بنابراین تعادل AUX/IAA­ها و­ARF ها یک نقطه کنترل کلیدی در سیگنالینگ اکسین بوده و این به خواص دینامیکی آنها برمی­گردد. اکسین تعادل را با تحریک پروتئولیز به واسطه یوبی­کوئیتین پروتئین­های AUX/IAA از طریق یوبی­کوئیتین لیگاز SCFTIR1 تغییر می­دهد و این فیدبک برای تنظیم رونویسی AUX/IAA می­باشد. اهمیت این مکانیسم در آنالیزهای ژنتیکی مشهود است (Liscum and Reed, 2002).
شکل-۱-۱۲- شمایی از ترارسانی علامت (Signal transduction) و تنظیم رشد گیاه.
روش­های تجربی بیوشیمیایی، مولکولی و ژنتیکی شواهد اولیه­ای را نشان می­ دهند که هر­دوی پروتئین­های ARF و AUX/IAA به عنوان عوامل رونویسی در ژن­های اولیه­ پاسخ به اکسین عمل می­ کنند. این اطلاعات نشان می­دهد که میان­کنش احتمالی بین ARFها و بین ARFها و AUX/IAA وجود دارد. همچنان که در بالا ذکر شد شواهدی وجود دارد که برخی از ARFها فعال­کننده بوده و سایر ARFها مهارکننده­ی ژن­های حساس به اکسین هستند. اطلاعات اضافی در مورد پروتئین­ها­ی AUX/IAA (به عنوان مثال، بیان بیش از حد پروتئین­های AUX/IAA در سیستم­های سنجش گذرا) دلالت بر این دارد که پروتئین­های AUX/IAA به عنوان مهار­کننده ژن­های حساس به اکسین عمل می­ کنند (Hagen and (Guilfoyle, 2002.
هم­اکنون شواهد قوی وجود دارد که تنظیم بیان ژن اکسین تحت­تاثیر سایر مسیرهای سیگنالی قرار می­گیرد. این شواهد عمدتا از خصوصیات موتانت­های پاسخ­دهی به اکسین به دست آمده است و نشان می­ دهند که سیگنالینگ اکسین به­واسطه تخریب پروتئین از طریق مسیر پروتئازوم/ یوبی کوئیتین، فسفریلاسیون پروتئین، نور و سایر هورمون­ها تحت­تاثیر قرار می­گیرد (Hagen and Guilfoyle, 2002) .
در این پژوهش، سعی شده است اثر تنش خشکی روی بیان چندین ژن مهم دخیل در مسیر ترارسانی علامت بررسی شود.
شناسایی ژن­های جدید، آنالیز الگوهای بیانی آنها در پاسخ به این تنش­ها و ارزیابی اعمال بالقوه آنها در سازگاری با تنش، استراتژی مهندسی موثری برای بهبود تحمل محصولات به تنش به ما ارائه خواهد داد. علاوه بر این، ارتباط بین فرایند­های زیستی گیاه در سطح فیزیولوژیک و ژنتیک نیز در این پژوهش مورد بحث قرار گرفته است.
.
فصل دوم :
مواد و روش­ها
۲-۱ شرایط رشد
برای رشد گیاهان از تکنیک کشت بافت (Tissue Culture) استفاده شد. بذرهای گیاه کلزا (B.napus) رقم اکاپی (Okapi) حساس به خشکی و رقم زرفام (Zarfam) مقاوم به خشکی از موسسه­ی تحقیقات اصلاح و تهیه­ نهال و بذر کرج بخش دانه­ های روغنی تهیه گردید. ابتدا بذرها با بهره گرفتن از اتانول ۷۰ درصد به مدت ۲ دقیقه و سپس با Bleach (هیپوکلریت سدیم) ۲۰ درصد به مدت ۱۰ دقیقه استریل و در نهایت ۴ بار با آب د­یونیزه شستشو شدند. بذرهای استریل شده به محیط MS پایه (Murashige & skoog basal medium) نیم­مرتبه (half-strength) تهیه شده از شرکت سیگما آمریکا ((Sigma M5519 با ۸/۵ pH=حاوی ۸/۰ درصد آگار (Plant agar, Sigma) منتقل شده و سپس به مدت ۸ روز در اتاق رشد تحت شرایط ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی در دمای ۲۵ درجه سانتی ­گراد با شدت نور µmol/m2.s2000 قرار گرفتند.
شکل-۲-۱- تصویر گیاهچه­های کلزا.
۲-۱-۱ نحوه تیمار­دهی گیاهان
گیاهچه­های (Seedlings) 8 روزه­ی کلزا به مدت ۲۴ ساعت و در سه دوره زمانی در معرض تنش خشکی قرار گرفتند. در مطالعه حاضر، به منظور اعمال تنش خشکی، گیاهچه­ها تحت تیمار مانیتول (Mannitol) 200 میلی­مولار قرار گرفته و به ۴ گروه تقسیم شدند:
گیاهان شاهد (Control): به این گروه مقدار ۴۰ میلی لیتر محلول MS (بدون آگار) در زیر هود لامینار و در شرایط کاملا استریل اضافه شده و سپس به مدت ۲۴ ساعت بر روی شیکر (Shaker) قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۳ ساعت (۳h): این گیاهان به مدت ۳ ساعت به منظور اعمال تنش خشکی، تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این دسته، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۳ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۱۲ ساعت (۱۲h): این گروه به مدت ۱۲ ساعت تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این دسته، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۱۲ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
گیاهان تیمار شده با خشکی به مدت ۲۴ ساعت (۲۴h): این گیاهان به مدت ۲۴ ساعت تحت تیمار مانیتول ۲۰۰ میلی مولار قرار گرفتند. به این گروه، مقدار ۵/۱۳ میلی لیتر مانیتول و ۵/۲۶ میلی لیتر MS اضافه گردیده و در نهایت به مدت ۲۴ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند.
آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی (CRD‌)[۴۱] با ۴ تیمار و هر تیمار در ۳ تکرار انجام گردید.
۲-۱-۲ برداشت نمونه
۲-۱-۲-۱ برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های مولکولی
پس از پایان تیمار تنش خشکی، به ترتیب طی زمان­های صفر (شاهد)، ۳، ۱۲ و ۲۴ ساعت، شیشه­های حاوی گیاهچه­ها را از روی شیکر برداشته و پس از خارج ساختن گیاهچه­ها و آب­گیری، آنها را در داخل فویل آلومینیومی قرار داده و بلافاصله در ازت مایع منجمد و در نهایت در فریزر ۸۰- درجه سانتی ­گراد موجود در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه نگهداری شدند.
۲-۱-۲-۲ برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های فیزیولوژیک
نمونه­برداری از کل Seedling انجام گرفت. پس از پایان تیمار تنش خشکی، به ترتیب طی زمان­های صفر (شاهد)، ۳، ۱۲ و ۲۴ ساعت، شیشه­های حاوی گیاهچه­ها را از روی شیکر برداشته و پس از خارج ساختن گیاهچه­ها و آب­گیری، آنها را در داخل فویل آلومینیومی قرار داده و بلافاصله به فریزر ۲۰- درجه سانتی ­گراد موجود در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه انتقال داده شدند. جهت تعیین وزن خشک برای برخی آزمایشات که نیاز به وزن خشک نمونه­ها داشت، ریشه­ها و ساقه­ها در آون ۸۰ درجه سانتی ­گراد به مدت ۴۸ ساعت قرار گرفتند. وزن خشک با ترازویی با حساسیت ۰۰۰۱/۰ گرم اندازه ­گیری شد.
۲-۲ روش­های بکار گرفته شده در آزمایشات مولکولی
۲-۲-۱ پودر کردن و آماده ­سازی نمونه جهت استخراج RNA
نمونه­های گیاهی در هاون حاوی نیتروژن مایع کوبیده شدند تا بخوبی پودر شوند. این عمل برای از بین بردن دیواره سلولی و غشای پلاسمایی نمونه­ها انجام می­گیرد تا استخراج RNA کل آنها قابل انجام باشد. نمونه­های پودر شده وارد لوله­های Eppendorf 15 میلی لیتری شده و تا زمان انجام آزمایش در فریزر ۸۰- درجه سانتی ­گراد نگهداری شدند. به این ترتیب دارای ۸ گروه نمونه پودر شده هستیم که شامل ۴ سری از رقم اکاپی و ۴ گروه از رقم زرفام می­باشند.
۲-۲-۲ استخراج RNA از بافت گیاهی
حدود ۲۰۰ میلی گرم از بافت نمونه مورد نظر در۵۰۰ میکرو لیتر Trizol® داخل تیوب (tube) 5/2 میلی لیتر ریخته و مخلوط بخوبیvortex گردید. سپس ۵۰۰ میکرو لیتر دیگر Trizol® به آن اضافه و دوباره مخلوط را vortex کرده و بمدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند.
۲۰۰ میکرولیتر کلروفرم به آن اضافه شده و مخلوط به خوبی vortex گردید.
مخلوط حاصل به مدت ۱۵ دقیقه در دور g14000 در دمای cº۴ با دستگاه سانتریفوژ ساخت شرکت eppendorf آلمان سانتریفوژ شدند.
مایع شفاف بالایی توسط پیپت از رسوبات کف تیوب جدا شده و به تیوب دیگری انتقال یافت.
۵۰۰ میکرو لیتر ایزوپروپانول به آن اضافه شده و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت.
محتوای تیوب­ها دور ریخته می­ شود و پلیت­های به جا مانده در کف تیوب­ها با ۱۵ میلی لیتر اتانول ۷۰% شسته شدند.
پس از آن تیوب­ها به مدت ۱ دقیقه در دمای cº۴ سانتریفوژ گشتند.

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت